Génomique
Le programme “Critical Path Initiative” de la FDA a identifié la toxicogénomique comme un des éléments clefs pour le développement des produits de santé. En effet, la transcriptomique (l’étude des modulations des ARN messagers) est considéré comme un des outils les plus efficaces pour élucider les mécanismes toxiques et prédire la toxicité.
La toxicogénomique est dorénavant utilisé en routine pour la détection précoce des problématiques de sécurité au cours des phases de recherche dans le développement pharmaceutique telles que :
- La découverte de biomarqueur.
- La génération des bases de données de signature des composés toxiques.
- La toxicologie mécanistique.
- Le tri des composes par comparaison des profiles d’expression génique.
- La toxicologie prédictive amont par comparaison avec les bases de données de signatures des composés toxiques.
Les services du CIT
CIT propose une solution complète de toxicogénomique intégrée allant des études terrains in vivo & in vitro jusqu’à l’analyse des données, en incluant:
- Une assistance dans le design personnalisé des projets de toxicogénomique (sélection de l’espèce appropriée, choix adéquat des temps et doses, prélèvement séquencé des organes au cours de des autopsies).
- Large panel de procédures pour les extractions d’ADN/ARN/µARN garantissant un très haut niveau de qualité des ADN/ARN/µARN à partir de plus de 50 tissus, fluides, cellules and écouvillons différents provenant de rongeurs, chiens et primates.
- Détection et suivi de toute séquence d’AND et d’ARN grâce à la PCR quantitative en temps réel (Applied Biosystems 7900 HT Fast).
- Réalisation des études règlementaires BPL de biodistribution dans le cadre des produits de thérapie génique ou vaccinale.
- Génération des profiles de transcriptome entier (pour ARN et µARN) sur puce Affymetrix GeneChip® (puce Whole Genome, puce Gene ST, puce µRNA).
- Génotypage clinique avec le format Affymetrix Human SNP 6.0.
- Analyse complète des données (du préprocessing jusqu’à l’analyse de voies métabolique/signalisation).
- Obtention rapide de données en toxicologie prédictive et mécanistiques par comparaison des données avec des bases de données de signature des composés toxiques.
Ces études sont réalisées suivant les méthodes de référence les plus rigoureuses.
Le pack Lead Screen
CIT propose un design d’étude courte et simple de toxicogénomique chez le rat permettant d’aborder les mécanismes toxicologiques et prédictifs d’un composé, en utilisant une combinaison dose/temps engendrant un impact maximal sur l’expression génique. Ce format peut être adapté selon vos propres objectifs (espèce, voie d’administration, dose, temps, périodicité de traitement) :
- 3 animaux pour chaque temps de prélèvement et par groupe,
- 1 groupe contrôle et 2 groupes traités (à la dose pharmacologique et à la dose maximale tolérée).
- Un minimum de trois temps de prélèvement sur une période courte de traitement (classiquement 4h, 48h et 5 jours après traitement).
- 71 puces (3 tissus (e.g. rein, foie, coeur) X 3 groupes x 3 animaux par groupe x 3 temps).
- Analyse complète des données au format client (du préprocessing jusqu’à l’analyse de voies métabolique/signalisation ainsi qu’un score de lésion prédictif à l’aide de DrugMatrix),
- Envoi du rapport sous 7 jours et transfert des données brutes sur un serveur FTP sécurisé.
Prélèvement des tissus couplé aux extractions d’ADN/ARN/µARN
Les prélèvements des tissus et les extractions des acides nucléiques sont réalisées dans un contexte BPL à l’aide de procédures opératoires standardisées et de contrôles qualités rigoureux : des facteurs clefs et critiques pour réussir un projet de toxicogénomique. L’équipe de Génomique du CIT vous offre son expertise et ses plateformes :
- Procédures spécifiques pour le prélèvement des organes en environnement exempt de toute nucléase.
- Techniciens de génomique expérimentés et hautement qualifiés.
- Plus de 27.000 extractions d’ARN conduits au cours des 36 derniers mois.
- Procédures spécifiques d’extraction d’ADN/ARN/µARN à partir de plus de 50 tissus, fluides, cellules and écouvillons différents provenant de rongeurs, chiens et primates.
- Quantification systématique (NanoDrop et Varioskan de chez Thermo) contrôle qualité (2100 Bioanalyzer de chez Agilent) sur les acides nucléiques purifiés avant toute étape ultérieure.
PCR quantitative en temps réel conforme aux BPL
PCR quantitative en temps réel conforme aux BPL réalisée avec la technologie Applied Biosystems 7900 HT Fast et la chimie TaqMan. Les divers formats Taqman ® Low-Density Array (TLDA) sont disponibles (détection simultanée de 12 à 380 gènes du simplicat au quadruplicat):
- Quantification absolue par PCR et RT-PCR simplex/multiplex incluant la validation préalable de l’essai qPCR ou RT-qPCR (spécificité, reproductibilité, stabilité, intervalle de linéarité, limite de détection, contrôle de l’inhibition).
- Quantification relative de tout transcrit ayant une séquence connue (jusqu’à 380 transcrits sur une même carte).
- Réalisation des dosages règlementaires BPL de biodistribution dans le cadre des produits de thérapie génique ou vaccinale.
- Génotypage de type SNP sur des échantillons cliniques.
Biodistribution dans le cadre des produits de thérapie génique ou vaccinale
Les études règlementaires de biodistribution sont une condition essentielle au cours de l’évaluation de sécurité préclinique d’un vecteur de thérapie génique (ADN ou ARN viral, plasmide, oligo antisens) ou d’un vaccin. Ces études fournissent des données de sécurité cruciales sur la persistance de l’ADN ou de l’ARN étranger au sein des organes et leur dissémination à travers le corps et les fluides.
CIT fournit une solution complète pour les études de biodistribution incluant :
- Agrément pour l’hébergement de la phase in vivo en conditions BSL1/BSL2.
- Procédures d’autopsie perfectionnées pour éviter les contaminations inter-organe.
- Extraction d’AND/ARN à partir de tissus, fluides et écouvillons (pièces d’extraction distinctes pour les groupes traité vs. contrôle).
- Quantification absolue par PCR et RT-PCR simplex/multiplex incluant la validation préalable de l’essai qPCR ou RT-qPCR (spécificité, reproductibilité, stabilité, intervalle de linéarité, limite de détection, contrôle de l’inhibition, détermination des rendements d’extraction).
- Toutes les phases étude sont conformes aux BPL.
Puce à AND ou microarray
Plateforme Affymetrix reconnue par Affymetrix comme « Authorized service provider ».
- Etudes sur puce transcriptome entier, comprenant le format Human Genome U133 Plus 2.0, Mouse Genome 430 2.0, Rat Genome 230 2.0, Canine Genome 2.0, Pig Genome, Bovine Genome, Human Gene ST 1.0, Rat Gene 1.0 ST et Mouse Gene 1.0 ST, ainsi que sur puce transcriptome µARN avec les cartouches miRNA 2xgain.
- Génotypage clinique (cluster SNP et analyse du nombre de copies) à l’aide des puces Genome-Wide Human SNP6.0.
- Techniciens de génomique expérimentés et hautement qualifiés (plus de 8000 marquages, hybridations et scans au cours des 12 derniers mois).
- Capacité >300 puces par semaine.
Bioinformatique & Biostatistique
Polyvalence des analyses de données
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Contrôle Qualité des données
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- Contrôle qualité des images
- Analyse des paramètres classiques de QCmetrics
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Préprocessing des données
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- Ajustement du bruit de fond, normalisation and « summarization »
- Différentes méthodes disponibles
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Analyse Exploratoire des données
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- Analyse en composantes Principales
- Classification Hiérarchique
- Matrice de Corrélation
- Analyse de la distribution du signal
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Filtrage des données
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- Fondé sur les ratios d’expression et /ou le seuil de probabilité critique
- Tests statistiques Approprié (Student, Student apparié, ANOVA, …)
- Correction des comparaisons multiples
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Annotation des données
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- A partir des informations les plus récentes chez Affymetrix
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Ontology Genique et analyses des voies
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- Fonction Moléculaire, processus biologique, compartiment cellulaire et enrichissement des voies à partir des données filtrées
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Edition des données
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- Rapport décrivant les méthodes d’analyse sélectionnées
- Fichiers Excel, texte, image ou html contenant les résultats obtenus
- Présentation personnalisée des résultats à la demande
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Transfert des données
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- Espace de travail internet eRoom sécurisé
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Outils disponibles
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- Affymetrix Expression console , R (Bioconductor), SAS
- Obtention rapide de données en toxicologie prédictive et mécanistiques par comparaison des données avec des bases de données de signature des composés toxiques (disponible fin Mars après le congrès SOT)
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Les études au CIT respectent les documents en vigueur émis par les instances règlementaires
Le texte de la FDA intitulé "Pharmacogenomics Data Submissions" édité en Mars 2005 expliquant aux Sponsors la position actuelle de l’agence au sujet de la soumission de données pharmacogénomiques. Actuellement, les données disponibles soumises à titre facultatif traitent de problématiques liées à la sécurité précliniques telles que hépato-toxicité des PPARs, la cardiotoxicité, les vascularites et la toxicité musculaire. Ces soumissions volontaires ont été inspectées par le nouveau groupe interdisciplinaire de la FDA appelé : Pharmacogenomics Review Group.
- Le même texte fournit une liste des biomarqueurs dans le contexte de soumissions règlementaires. Le champ d’application de ce texte a été étendu aux méthodes de validation de biomarqueur de sécurité préclinique grâce au "Predictive Safety Testing Consortium" (PSTC), qui inclut parmi ses membres : la FDA, l’institut Critical Path et la plupart des compagnies leaders pharmaceutiques.
- Le texte MAQC (MicroArray Quality Control) ainsi qu’un article préliminaire de la FDA intitulé "Recommendations for the Generation and Submission of Genomic Data" de Novembre 2006 ont pour objectifs d’expliquer les biais expérimentaux à éviter aux cours des expériences de puce à ADN.
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